蛋白印迹實驗封閉蛋白選哪種，牛奶或 BSA？

脫脂奶粉或牛血清白蛋白 (BSA) 會如何影響你的蛋白印迹結果。

關于蛋白印迹 WB 實驗，我們常遇到一個問題，我該用(yòng)什麽來封閉，牛奶或 BSA？

首先，我們需要了解封閉的目的：減少因非特異性結合而産(chǎn)生的背景。其次，我們需要知道 BSA 和牛奶的區(qū)别：BSA 僅由一種蛋白組成，即 60 kDa 的牛血清白蛋白；而牛奶則由許多(duō)大小(xiǎo)不一的蛋白構成。

所以，CST (Cell Signaling Technology) 推薦牛奶封閉最佳，因為(wèi)牛奶有(yǒu)更大的機會來減少更多(duō)的非特異性結合。我們建議您用(yòng)經 TBST 稀釋的 5% 牛奶，在室溫下搖晃一小(xiǎo)時，來封閉CST所有(yǒu)非偶聯一抗，這包括磷酸化特異性和總抗體(tǐ)。

現在，曾有(yǒu)同學(xué)問過，“牛奶中(zhōng)的磷酸酶會怎麽樣？” 或許有(yǒu)一些文(wén)章反對使用(yòng)牛奶來檢測磷酸化信号，這一誤區(qū)的出現可(kě)能(néng)是由于實驗者使用(yòng)了非實驗級奶粉引起的（國(guó)内許多(duō)奶粉含有(yǒu)磷酸酶等雜質(zhì)），但在 CST 的所有(yǒu)内部檢測中(zhōng)，科(kē)學(xué)家們進行了多(duō)次蛋白印迹實驗，從未發現任何這樣的問題。CST建議轉膜後迅速在TBS中(zhōng)洗滌膜幾秒(miǎo)，以便移除殘留的轉膜緩沖液，随後使用(yòng)5%脫脂牛奶（請使用(yòng)實驗級的#9999）的TBST室溫封閉1h。另外，CST科(kē)學(xué)家們每天至少要新(xīn)鮮配制一次牛奶，有(yǒu)時甚至一天配制多(duō)次，因為(wèi)如果牛奶緩沖液放置了一周、兩周甚至更長(cháng)時間不使用(yòng)，那麽磷酸酶影響信号的機率将會增加。

上圖是(Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb) #13038 用(yòng)來檢測經 PDGF 處理(lǐ)的 3T3 細胞裂解物(wù)的結果圖片。左側膜是用(yòng)牛奶封閉，右側膜用(yòng) BSA 封閉。顯然，用(yòng) BSA 封閉的膜的背景更高。但用(yòng)牛奶封閉膜時，磷酸化信号仍然很(hěn)強且清晰。

封閉後，請仔細查看一抗的說明書，根據推薦的一抗緩沖液來稀釋一抗，一般推薦牛奶或 BSA，但取決于不同抗體(tǐ)。

希望本篇講述的實驗細節對您的實驗有(yǒu)所幫助。全部特定應用(yòng)的實驗步驟可(kě)在 cst-c.com.cn 具(jù)體(tǐ)産(chǎn)品頁(yè)上找到。如果你有(yǒu)任何其他(tā)技(jì )術問題，請郵件聯系[email protected]，或可(kě)撥打全國(guó)免費技(jì )術熱線(xiàn)：4006-GreatQ（473287）。

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