單細胞測序技(jì )術是近年來迅速發展的生命科(kē)學(xué)前沿技(jì )術，它在單細胞水平揭示細胞的基因表達狀态，反映細胞間的異質(zhì)性，為(wèi)生命科(kē)學(xué)的研究提供了獨特的視角。近年來，單細胞測序技(jì )術在神經科(kē)學(xué)、腫瘤、發育生物(wù)學(xué)、微生物(wù)學(xué)等衆多(duō)領域發揮着重要的作(zuò)用(yòng)，成為(wèi)了生命科(kē)學(xué)極具(jù)潛力的熱點研究工(gōng)具(jù)。單細胞測序結果的真實性，不同檢測信息在組織中(zhōng)的特異分(fēn)布，與檢測結果的生物(wù)學(xué)意義密切相關。故在單細胞測序後重要靶點的原位回溯具(jù)有(yǒu)重要的生物(wù)學(xué)分(fēn)析意義。RNAscope原位雜交技(jì )術能(néng)直觀可(kě)視化基因表達的空間位置，無懼新(xīn)發現靶點無免疫組化抗體(tǐ)，分(fēn)泌因子或者靶點為(wèi)非編碼RNA等情況，因此RNAscope對于單細胞測序的結果回溯到組織原位上進行驗證提供了重要的技(jì )術手段。本文(wén)為(wèi)大家解讀2020年發表的使用(yòng)RNAscope技(jì )術在單細胞測序後驗證中(zhōng)的應用(yòng)系列文(wén)章。

2020年在communication biology上發表的一篇題為(wèi)Single-cell Transcriptomes of The Human Hkin Reveal Age-related Loss of Fibroblast Priming的研究中(zhōng)，利用(yòng)單細胞測序系統分(fēn)析了人皮膚成纖維細胞的轉錄組，鑒定了四個主要的成纖維細胞亞群，這些亞群可(kě)以在空間上定位并顯示不同的分(fēn)泌、間充質(zhì)和促炎功能(néng)，為(wèi)人類真皮成纖維細胞的功能(néng)特化提供了證據，并且發現細胞特性的部分(fēn)喪失是人類真皮中(zhōng)與年齡相關的重要變化。

在這項研究中(zhōng)，研究人員從兩名(míng)年輕（25歲和27歲）和三名(míng)年長(cháng)（53歲、69歲和70歲）的捐贈者身上獲取了全皮膚樣本，而且為(wèi)了盡量減少皮膚的光老化效應，這些樣本是從男性捐贈者的防曬區(qū)域的腹股溝髂區(qū)獲得的。然後對獲得的皮膚樣本進行單細胞測序，單細胞測序結果以及數據分(fēn)析鑒定了4個成纖維細胞亞群，第一個亞群是位于網狀真皮中(zhōng)的分(fēn)泌性網狀成纖維細胞，第二個亞群是位于乳頭狀真皮中(zhōng)的分(fēn)泌性乳頭狀成纖維細胞，第三個亞群被預測具(jù)有(yǒu)廣泛的定位，顯示出更大的間充質(zhì)潛能(néng)的間充質(zhì)成纖維細胞，第四個亞群是促炎症細胞群（見下圖）。

為(wèi)了進一步表征和驗證單細胞測序鑒定的四個成纖維細胞亞群，研究人員使用(yòng)Bio-Techne旗下ACD公(gōng)司的RNAscope技(jì )術，在福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）皮膚切片中(zhōng)原位檢測了每個亞群最具(jù)代表性的标志(zhì)基因的表達。研究人員使用(yòng)的是RNAscope多(duō)通道熒光檢測的方法，分(fēn)别檢測了分(fēn)泌性網狀成纖維細胞的标志(zhì)基因CTHRC1（下圖a中(zhōng)綠色信号點）和分(fēn)泌性乳頭狀成纖維細胞的标志(zhì)基因APCDD1的表達（下圖a中(zhōng)紅色信号點），并檢測了泛成纖維細胞标志(zhì)基因PDGFRA的表達作(zuò)為(wèi)對照（下圖a中(zhōng)白色信号點），RNAscope的檢測結果證實了每個分(fēn)泌亞群在乳頭狀真皮層和網狀真皮層中(zhōng)的位置，并且通過RNAscope結果的定量分(fēn)析可(kě)以統計分(fēn)别表達CTHRC1與APCDD1的陽性細胞比例，從而得到在乳頭狀真皮層和網狀真皮層中(zhōng)兩個分(fēn)泌亞群細胞的相對數量。

對于另外兩個成纖維細胞亞群，研究人員同樣使用(yòng)RNAscope多(duō)通道熒光檢測的方法，分(fēn)别檢測了促炎成纖維細胞的标志(zhì)基因CCL19與APOE的表達（下圖b中(zhōng)綠色信号點為(wèi)RNAscope檢測到的CCL19的RNA信号，紅色信号點為(wèi)APOE的RNA信号），與間充質(zhì)亞群的标志(zhì)基因ASPN的表達（下圖c中(zhōng)綠色信号點）。RNAscope的檢測結果證實促炎成纖維細胞顯示出更廣泛的分(fēn)布，在脈管中(zhōng)的分(fēn)布證實其與血管系統的優先關聯。間充質(zhì)亞群主要定位于網狀真皮，尤其是毛囊附近。因此，RNAscope原位檢測結果為(wèi)研究人員通過單細胞轉錄組學(xué)獲得的發現提供了重要的證據，并為(wèi)檢測特定成纖維細胞亞群建立了标記。

RNAscope技(jì )術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公(gōng)司研發的RNA原位雜交産(chǎn)品，在近年來的生物(wù)檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技(jì )術屬于新(xīn)一代RNA原位雜交技(jì )術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長(cháng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理(lǐ)，可(kě)以高效敏感地檢測到目标RNA。該方法的具(jù)體(tǐ)優勢如下：

應用(yòng)廣泛 

使用(yòng)RNAscope技(jì )術，靶點RNA為(wèi)大于等于300個堿基的特異序列，即可(kě)進行探針設計。因而RNAscope技(jì )術可(kě)以應用(yòng)于幾乎所有(yǒu)物(wù)種，所有(yǒu)組織以及所有(yǒu)基因的檢測。

特異性強

RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有(yǒu)效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景幹擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會産(chǎn)生完整的信号放大分(fēn)子結合位點，并會在雜交過程中(zhōng)被洗脫掉，從而防止非特異性信号的放大，使得探針的信号具(jù)有(yǒu)高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可(kě)完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測每個RNA 分(fēn)子時，隻需三對雙Z（ZZ）探針即可(kě)完成雜交和信号的可(kě)視化。

單分(fēn)子可(kě)視化和單細胞定量

使用(yòng)RNAscope技(jì )術雜交上三對及以上雙Z 探針即可(kě)在标準的顯微鏡下呈現可(kě)觀察到的點狀信号。ACD公(gōng)司提供的分(fēn)析軟件更可(kě)以定量每一個單細胞内RNA 的表達水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對雙Z探針即可(kě)檢測到目标RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為(wèi)20對雙Z 探針，因而即使目标RNA發生部分(fēn)降解，仍可(kě)以穩定有(yǒu)效地檢測到靶點RNA。

檢測結果穩定一緻性

RNAscope技(jì )術用(yòng)到的探針以及所有(yǒu)檢測試劑全部由工(gōng)業化合成，且該技(jì )術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有(yǒu)成熟的實驗操作(zuò)流程，故使得RNAscope技(jì )術檢測結果具(jù)有(yǒu)穩定性和一緻性。除了可(kě)以在實驗室進行手工(gōng)操作(zuò)外，該産(chǎn)品也可(kě)以在Leica以及羅氏Ventana自動平台上運行，為(wèi)結果的一緻性和穩定性提供了可(kě)靠的依據。

多(duō)通道多(duō)靶點同時檢測

由于RNAscope技(jì )術可(kě)以同時進行多(duō)通道探針雜交以及信号放大，故在可(kě)見光檢測中(zhōng)可(kě)以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中(zhōng)，可(kě)以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。

References

1. Llorenç Solé-Boldo, Günter Raddatz, Sabrina Schütz, et al. Single-cell transcriptomes of the human skin reveal age-related loss of fibroblast priming. Commun Biol. 2020; 23;3(1):188.