負責我們認知、意識的神經活動主要發生于我們大腦内部，負責體(tǐ)表的一系列感覺有(yǒu)外周神經通路，而對于我們體(tǐ)腔内的内髒器官的感覺傳入和神經支配，則主要由迷走神經完成。迷走神經負責的組織器官多(duō)樣，功能(néng)也各不相同，但迷走神經核團是如何對各個内髒的傳入信息進行區(qū)分(fēn)和編碼，目前了解的不甚清晰。不同器官傳入的神經元涉及種類繁多(duō)，對不同刺激産(chǎn)生應答(dá)，了解不同類型神經元的空間分(fēn)布及分(fēn)類特點，對于理(lǐ)解信息如何編碼彙聚非常重要。2022年3月，美國(guó)耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院的常瑞實驗室與張樂實驗室合作(zuò)在Nature上發表了一篇研究，通過使用(yòng)RNAscope HiPlex結合單細胞測序、活體(tǐ)鈣成像等技(jì )術，對迷走神經元進行了空間及細胞活動特征的研究^[1]。

作(zuò)者先在小(xiǎo)鼠不同器官内分(fēn)别注射帶有(yǒu)熒光标記和不同barcode的逆行AAV病毒，以此标記不同器官來源的迷走神經。然後分(fēn)離出标記好的迷走神經元做單細胞測序，篩選總結出大量靶标，及不同靶标在每類神經元中(zhōng)的相對表達量。随後作(zuò)者使用(yòng)RNAscope HiPlex技(jì )術對篩選出的不同器官來源的迷走神經元中(zhōng)感興趣靶标進行了原位驗證，并将此方法稱之為(wèi)“Projection-seq” （圖1）。在多(duō)個組織器官來源的迷走神經元中(zhōng)原位驗證結果與單細胞測序結果匹配良好，且各靶标相對表達量與單細胞測序接近。

圖1. Projection-seq驗證肺髒投射來源不同亞群迷走神經元的靶标分(fēn)布。

随後，作(zuò)者在迷走神經元中(zhōng)泛表達鈣指示劑GCamP6s，并在Gpr65陽性神經元中(zhōng)表達紅色熒光蛋白指示劑，用(yòng)于對神經元進行定位。通過對小(xiǎo)鼠肺、食管、胃腸道等不同内髒器官或不同節段分(fēn)别進行機械刺激，同時記錄迷走神經元的鈣反應情況，之後，再結合RNAscope HiPlex技(jì )術，對迷走神經元進行多(duō)靶标染色，通過紅色熒光蛋白定位，将RNA原位信息與鈣活動信息整合到一起。作(zuò)者将此方法命名(míng)為(wèi)“vCatFISH”。通過vCatFISH，得以讓我們看到對于相同器官的同一刺激，會有(yǒu)表達不同基因的神經元産(chǎn)生反應，說明對于同樣的刺激，在迷走神經元中(zhōng)也存在多(duō)個維度的編碼。神經系統通過對不同維度信息進行整合，最終幫助我們實現對刺激強度、時間、位置等具(jù)體(tǐ)細節的區(qū)分(fēn)，從而使機體(tǐ)對不同情況進行應對。而本篇文(wén)章的工(gōng)作(zuò)幫助我們未來對神經活動進行解碼提供了一種新(xīn)的選擇和啓發。

圖2. vCatFISH技(jì )術揭示了對于機體(tǐ)不同刺激反應的神經元的基因特征。

RNAscope技(jì )術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公(gōng)司研發的RNA原位雜交産(chǎn)品，在近年來的生物(wù)檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技(jì )術屬于新(xīn)一代RNA原位雜交技(jì )術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長(cháng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理(lǐ)，可(kě)以高效敏感地檢測到目标RNA。該方法的具(jù)體(tǐ)優勢如下：

應用(yòng)廣泛 

使用(yòng)RNAscope技(jì )術，靶點RNA為(wèi)大于等于300個堿基的特異序列，即可(kě)進行探針設計。因而RNAscope技(jì )術可(kě)以應用(yòng)于幾乎所有(yǒu)物(wù)種，所有(yǒu)組織以及所有(yǒu)基因的檢測。

特異性強

RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有(yǒu)效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景幹擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會産(chǎn)生完整的信号放大分(fēn)子結合位點，并會在雜交過程中(zhōng)被洗脫掉，從而防止非特異性信号的放大，使得探針的信号具(jù)有(yǒu)高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可(kě)完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測每個RNA 分(fēn)子時，隻需三對雙Z（ZZ）探針即可(kě)完成雜交和信号的可(kě)視化。

單分(fēn)子可(kě)視化和單細胞定量

使用(yòng)RNAscope技(jì )術雜交上三對及以上雙Z 探針即可(kě)在标準的顯微鏡下呈現可(kě)觀察到的點狀信号。ACD公(gōng)司提供的分(fēn)析軟件更可(kě)以定量每一個單細胞内RNA 的表達水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對雙Z探針即可(kě)檢測到目标RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為(wèi)20對雙Z 探針，因而即使目标RNA發生部分(fēn)降解，仍可(kě)以穩定有(yǒu)效地檢測到靶點RNA。

檢測結果穩定一緻性

RNAscope技(jì )術用(yòng)到的探針以及所有(yǒu)檢測試劑全部由工(gōng)業化合成，且該技(jì )術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有(yǒu)成熟的實驗操作(zuò)流程，故使得RNAscope技(jì )術檢測結果具(jù)有(yǒu)穩定性和一緻性。除了可(kě)以在實驗室進行手工(gōng)操作(zuò)外，該産(chǎn)品也可(kě)以在Leica以及羅氏Ventana自動平台上運行，為(wèi)結果的一緻性和穩定性提供了可(kě)靠的依據。

多(duō)通道多(duō)靶點同時檢測

由于RNAscope技(jì )術可(kě)以同時進行多(duō)通道探針雜交以及信号放大，故在可(kě)見光檢測中(zhōng)可(kě)以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中(zhōng)，可(kě)以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。

在RNAscope技(jì )術的基礎上，ACD公(gōng)司旗下的Basescope技(jì )術可(kě)以檢測RNA水平的外顯子跳躍，點突變，環狀RNA等；miRNAscope可(kě)以原位對小(xiǎo)RNA，包括miRNA, siRNA, ASO進行追蹤定位；而近年來推出的RNAscope HiPlex技(jì )術則可(kě)以在一張石蠟切片上同時檢測最多(duō)12個RNA靶标的分(fēn)布定位，成為(wèi)神經科(kē)學(xué)，腫瘤微環境研究以及單細胞測序後驗證等領域的常用(yòng)檢測方法。