美國(guó)Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公(gōng)司的RNAscope技(jì )術作(zuò)為(wèi)新(xīn)一代的RNA原位雜交技(jì )術，通過其專利的雙Z探針設計原理(lǐ)以及信号級聯放大系統，可(kě)以兼容由于空氣中(zhōng)RNA酶對于RNA的部分(fēn)降解導緻一定程度的組織RNA缺損，從而達到對組織和細胞内的RNA進行高效的原位檢測。

在使用(yòng)RNAscope，Basescope以及miRNAscope對石蠟樣本，新(xīn)鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進行原位雜交的過程中(zhōng)，經常會遇到各種各樣的技(jì )術問題。前三期我們就樣本制備，樣本預處理(lǐ)的一些注意細節，以及問題樣本預處理(lǐ)調整方案進行了探讨，本期繼續就其他(tā)一些客戶常見問題給大家提供一些相關小(xiǎo)貼士。

在解決了樣本制備和預處理(lǐ)問題後，客戶還會遇到的一些RNAscope檢測常見問題有(yǒu)：

1  掉片問題

掉片多(duō)見于石蠟樣本和固定冰凍樣本。說是多(duō)見，并不意味着這是一個普遍現象，通常按照ACD産(chǎn)品說明書裏的樣本制備方法進行的樣本制備和其他(tā)标準流程操作(zuò)，掉片現象并不常見。當發現實驗中(zhōng)出現掉片現象時，可(kě)以通過以下幾點進行調整：

01

确保使用(yòng)高粘附載玻片

與免疫組化不同，ACD的包括RNAscope, Basescope，miRNAscope等的操作(zuò)流程相對較長(cháng)，除前期預處理(lǐ)的三個主要步驟，探針雜交2小(xiǎo)時以外，後續還要根據檢測試劑盒的不同，有(yǒu)若幹步Amp的孵育，直到最後顯色（可(kě)見光或者熒光）。所以公(gōng)司推薦使用(yòng)高粘附的進口載玻片進行組織切片的粘附和後續檢測。具(jù)體(tǐ)可(kě)選用(yòng)的載玻片請參見說明書或直接與我公(gōng)司的技(jì )術人員交流([email protected])。

02

按照公(gōng)司推薦的标準流程制備組織樣本

具(jù)體(tǐ)的樣本制備方法在前幾期的軟文(wén)以及公(gōng)司産(chǎn)品說明書裏都有(yǒu)描述，這裏不再贅述。

03

在進行貼片時盡量避免氣泡，适當延長(cháng)烤片時間

貼片時，當組織切片與載玻片間沒有(yǒu)完全牢固貼合上，則會降低由于電(diàn)荷間吸附力下降導緻的空隙，在後續檢測時，這些不牢固區(qū)域會導緻掉片；石蠟切片建議在60℃烤箱烤1小(xiǎo)時。在脫片的情況下，可(kě)以适當延長(cháng)到1個半小(xiǎo)時。而固定冰凍樣本切片也可(kě)以通過增加烤片環節增加粘附（時間可(kě)以控制在60℃半小(xiǎo)時）。

04

對于石蠟切片和固定後冰凍切片，如果遵守上述操作(zuò)後仍然有(yǒu)掉片問題，可(kě)以參考增加以下步驟進行操作(zuò)。

石蠟切片可(kě)以在第一步烤片後或者target retrieval之後增加烤片環節，降低脫片問題（見上圖）。

固定後冰凍切片可(kě)以在上圖的I（-20℃低溫幹燥2小(xiǎo)時），II（進行後固定），III（增加烤片60℃ 30分(fēn)鍾環節）和IV（去除煮沸步驟但是同時增加蛋白酶處理(lǐ)）環節進行相應調整。最終達到以下右圖效果。

2  靶探針沒有(yǒu)結果

在遇到這類問題時，第一時間需要确認樣本的陽性對照探針（通常包括PPIB或者UBC）和陰性對照探針(DapB)結果如何。在衆多(duō)此類問題中(zhōng)，有(yǒu)一多(duō)半的客戶在确認了陽對和陰對探針結果後，都可(kě)以很(hěn)好的回答(dá)靶探針沒信号的問題。即由于樣本本身制備過程中(zhōng)未按照标準流程，固定不充分(fēn)，導緻RNA大幅度降解，故無法檢測到靶探針信号。

針對樣本質(zhì)量沒有(yǒu)問題的客戶，則可(kě)以與我們的技(jì )術人員聯系（[email protected]），尋求進一步的幫助和指導。

3  特殊樣本怎麽辦(bàn)

在常規的樣本外，經常會遇到客戶使用(yòng)的是包括類器官，骨骼樣本以及血液等較為(wèi)特殊的樣本類型，對于這些種類的樣本，有(yǒu)專門的樣本處理(lǐ)和制備方法，可(kě)以幫助完成前期包括固定，脫鈣，包埋等一系列問題，最終放置到載玻片上進行常規RNAscope, Basescope等檢測。相關制備細節可(kě)參見本公(gōng)衆号之前發表的軟文(wén)，或與我們的技(jì )術部門同事聯系詢問細節。

最後，在開始實驗前注意以下環節，将有(yǒu)助于避免實驗中(zhōng)的常見錯誤，保證整個實驗的順利進行。

下一期，我們将RNAscope熒光檢測的一些常見問題進行探讨，與大家一起了解并加深熒光檢測的操作(zuò)細節和關鍵點。

RNAscope技(jì )術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公(gōng)司研發的RNA原位雜交産(chǎn)品，在近年來的生物(wù)檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技(jì )術屬于新(xīn)一代RNA原位雜交技(jì )術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長(cháng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理(lǐ)，可(kě)以高效敏感地檢測到目标RNA。該方法的具(jù)體(tǐ)優勢如下：

應用(yòng)廣泛 

使用(yòng)RNAscope技(jì )術，靶點RNA為(wèi)大于等于300個堿基的特異序列，即可(kě)進行探針設計。因而RNAscope技(jì )術可(kě)以應用(yòng)于幾乎所有(yǒu)物(wù)種，所有(yǒu)組織以及所有(yǒu)基因的檢測。

特異性強

RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有(yǒu)效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景幹擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會産(chǎn)生完整的信号放大分(fēn)子結合位點，并會在雜交過程中(zhōng)被洗脫掉，從而防止非特異性信号的放大，使得探針的信号具(jù)有(yǒu)高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可(kě)完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測每個RNA 分(fēn)子時，隻需三對雙Z（ZZ）探針即可(kě)完成雜交和信号的可(kě)視化。

單分(fēn)子可(kě)視化和單細胞定量

使用(yòng)RNAscope技(jì )術雜交上三對及以上雙Z 探針即可(kě)在标準的顯微鏡下呈現可(kě)觀察到的點狀信号。ACD公(gōng)司提供的分(fēn)析軟件更可(kě)以定量每一個單細胞内RNA 的表達水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對雙Z探針即可(kě)檢測到目标RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為(wèi)20對雙Z 探針，因而即使目标RNA發生部分(fēn)降解，仍可(kě)以穩定有(yǒu)效地檢測到靶點RNA。

檢測結果穩定一緻性

RNAscope技(jì )術用(yòng)到的探針以及所有(yǒu)檢測試劑全部由工(gōng)業化合成，且該技(jì )術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有(yǒu)成熟的實驗操作(zuò)流程，故使得RNAscope技(jì )術檢測結果具(jù)有(yǒu)穩定性和一緻性。除了可(kě)以在實驗室進行手工(gōng)操作(zuò)外，該産(chǎn)品也可(kě)以在Leica以及羅氏Ventana自動平台上運行，為(wèi)結果的一緻性和穩定性提供了可(kě)靠的依據。

多(duō)通道多(duō)靶點同時檢測

由于RNAscope技(jì )術可(kě)以同時進行多(duō)通道探針雜交以及信号放大，故在可(kě)見光檢測中(zhōng)可(kě)以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中(zhōng)，可(kě)以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。