美國(guó)Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公(gōng)司的RNAscope技(jì )術作(zuò)為(wèi)新(xīn)一代的RNA原位雜交技(jì )術，通過其專利的雙Z探針設計原理(lǐ)以及信号級聯放大系統，可(kě)以兼容由于空氣中(zhōng)RNA酶對于RNA的部分(fēn)降解導緻一定程度的組織RNA缺損，從而達到對組織和細胞内的RNA進行高效的原位檢測。

在使用(yòng)RNAscope，Basescope以及miRNAscope對石蠟樣本，新(xīn)鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進行原位雜交的過程中(zhōng)，經常會遇到各種各樣的技(jì )術問題。本專題就一系列典型代表性的問題進行歸類總結。本篇聚焦樣本制備步驟，給大家提供一些相關小(xiǎo)貼士。

對于RNAscope類實驗的樣本制備，說明書裏有(yǒu)比較詳細的說明。需要注意的事項有(yǒu)以下一些：

石蠟樣本的制備中(zhōng)，在冰上取材後建議第一時間放入10%中(zhōng)性福爾馬林固定液（10%NBF）浸泡16-32小(xiǎo)時。固定液的體(tǐ)積建議至少是組織體(tǐ)積的10-20倍。充分(fēn)固定組織樣本是RNA原位檢測的成敗關鍵之一。經過充分(fēn)固定的組織樣本内的RNA可(kě)以與蛋白進行交聯。從而達到最佳的保護效果。

對于新(xīn)鮮冰凍樣本制備，需要提前準備好冰凍包埋模具(jù)（如下圖）以及倒入模具(jù)備用(yòng)的OCT，以及盛有(yǒu)幹冰的盒子或者-80℃冰箱。在組織取材時，在冰上将組織剝離後，切成适當大小(xiǎo)後浸入預先倒入OCT的包埋模具(jù)中(zhōng)，之後快速将含有(yǒu)組織塊和OCT包埋模具(jù)放入裝(zhuāng)有(yǒu)幹冰的封閉盒子内或者直接放入-80℃冰箱。每個包埋模具(jù)浸入組織後第一時間放入幹冰或者-80℃内進行冷凍保存。不建議積攢一批後再進行後續操作(zuò)。組織樣本要在幹冰或者-80℃冰箱内至少過夜保存後再進行切片處理(lǐ)。

對于灌注固定的樣本，建議客戶使用(yòng)新(xīn)鮮配制的4%多(duō)聚甲醛（4%PFA）對動物(wù)進行灌注固定。組織取材後繼續放入新(xīn)鮮的4%多(duō)聚甲醛（4% PFA）在4℃進行固定24小(xiǎo)時。之後依次浸入15%和30%的蔗糖溶液中(zhōng)（4℃）至樣本沉入底部（依據樣本大小(xiǎo)不同時間不同）。此步可(kě)以保護組織細胞形态。之後将組織塊浸入裝(zhuāng)有(yǒu)OCT的組織包埋盒内，放入-80℃冰箱至少過夜後在進行切片制備。此步有(yǒu)一個關鍵點即4%多(duō)聚甲醛的有(yǒu)效性問題。由于多(duō)聚甲醛屬于強還原性試劑，故不像10%中(zhōng)性福爾馬林固定液那樣可(kě)以在室溫長(cháng)期保存。4%PFA會随着時間發生氧化，從而固定效果大打折扣。為(wèi)了最大程度的維持4%PFA的固定效果，建議使用(yòng)新(xīn)鮮配制（當天配置）的4%PFA進行固定。如果當日不方便配置，可(kě)以事先配置好4%PFA，分(fēn)裝(zhuāng)并直接凍在-20℃，使用(yòng)前拿(ná)出一隻融化後立即使用(yòng)。

一般依據以上提示制備的組織石蠟塊或者冰凍組織塊，進行後續常規切片并相應的RNAscope, Basescope或者miRNAscope檢測，組織樣本可(kě)以通過質(zhì)控（QC）檢測，即陽性對照探針檢測評分(fēn)≧2，陰性對照為(wèi)0。值得注意的是，石蠟塊相較于冰凍組織塊，可(kě)以更為(wèi)長(cháng)期的保存。經驗證經過上述标準化固定5-10年的石蠟塊在進行了石蠟切片後仍然可(kě)以通過RNAscope質(zhì)控檢測，并進行靶探針檢測。值得注意的事，石蠟切片一旦切出來後，需要在2個月内完成實驗。

除了常規組織樣本外，有(yǒu)研究團隊使用(yòng)到1）微小(xiǎo)組織樣本，例如類器官，3D培養細胞團或者小(xiǎo)型昆蟲等樣本；2）骨骼組織或軟骨樣本；3）血液樣本進行RNAscope檢測，這幾類樣本同樣可(kě)以制備成石蠟塊，并進行RNAscope檢測。針對于這類樣本的石蠟塊制備流程，本公(gōng)衆号之前的有(yǒu)相關樣本制備的軟文(wén)參考。骨骼樣本固定， 脫鈣及制備方法請參見題目為(wèi)：RNA原位檢測中(zhōng)，骨和軟骨樣本制備處理(lǐ)技(jì )術淺談及應用(yòng)；微小(xiǎo)樣本制備請參見1）題目為(wèi)：RNAscope技(jì )術在類器官中(zhōng)的應用(yòng)舉例以及類器官石蠟樣本制備簡介；以及2）題目為(wèi)：在談RNAscope技(jì )術與類器官的相關文(wén)章。更多(duō)類型樣本制備，例如血液樣本制備等問題可(kě)直接與我公(gōng)司FAS團隊或者通過本公(gōng)衆号聯系詢問。

RNAscope技(jì )術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公(gōng)司研發的RNA原位雜交産(chǎn)品，在近年來的生物(wù)檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技(jì )術屬于新(xīn)一代RNA原位雜交技(jì )術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長(cháng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理(lǐ)，可(kě)以高效敏感地檢測到目标RNA。該方法的具(jù)體(tǐ)優勢如下：

應用(yòng)廣泛 

使用(yòng)RNAscope技(jì )術，靶點RNA為(wèi)大于等于300個堿基的特異序列，即可(kě)進行探針設計。因而RNAscope技(jì )術可(kě)以應用(yòng)于幾乎所有(yǒu)物(wù)種，所有(yǒu)組織以及所有(yǒu)基因的檢測。

特異性強

RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有(yǒu)效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景幹擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會産(chǎn)生完整的信号放大分(fēn)子結合位點，并會在雜交過程中(zhōng)被洗脫掉，從而防止非特異性信号的放大，使得探針的信号具(jù)有(yǒu)高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可(kě)完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測每個RNA 分(fēn)子時，隻需三對雙Z（ZZ）探針即可(kě)完成雜交和信号的可(kě)視化。

單分(fēn)子可(kě)視化和單細胞定量

使用(yòng)RNAscope技(jì )術雜交上三對及以上雙Z 探針即可(kě)在标準的顯微鏡下呈現可(kě)觀察到的點狀信号。ACD公(gōng)司提供的分(fēn)析軟件更可(kě)以定量每一個單細胞内RNA 的表達水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對雙Z探針即可(kě)檢測到目标RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為(wèi)20對雙Z 探針，因而即使目标RNA發生部分(fēn)降解，仍可(kě)以穩定有(yǒu)效地檢測到靶點RNA。

檢測結果穩定一緻性

RNAscope技(jì )術用(yòng)到的探針以及所有(yǒu)檢測試劑全部由工(gōng)業化合成，且該技(jì )術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有(yǒu)成熟的實驗操作(zuò)流程，故使得RNAscope技(jì )術檢測結果具(jù)有(yǒu)穩定性和一緻性。除了可(kě)以在實驗室進行手工(gōng)操作(zuò)外，該産(chǎn)品也可(kě)以在Leica以及羅氏Ventana自動平台上運行，為(wèi)結果的一緻性和穩定性提供了可(kě)靠的依據。

多(duō)通道多(duō)靶點同時檢測

由于RNAscope技(jì )術可(kě)以同時進行多(duō)通道探針雜交以及信号放大，故在可(kě)見光檢測中(zhōng)可(kě)以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中(zhōng)，可(kě)以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。