1.限制性内切酶實驗問題指南

2.高保真限制性内切酶常見問題解答(dá)

Q. 為(wèi)什麽 HF 内切酶推薦使用(yòng)的緩沖液與野生型的内切酶不同？

A. 在許多(duō)情況下，突變導緻高保真内切酶的最适緩沖液發生變化。比如，野生型 SalI 酶的最适緩沖液 NEBuffer 3.1 是高離子強度緩沖液，然而 SalI-HF^™ 的最适緩沖液為(wèi)中(zhōng)等離子強度的 NEBuffer 2.1 和 CutSmart。

Q. 使用(yòng) CutSmart 緩沖液有(yǒu)什麽優勢嗎？

A. 是的，超過 200 種限制性内切酶（包括高保真限制性内切酶）在 CutSmart 緩沖液中(zhōng)有(yǒu)活性。當建立雙酶切
反應時有(yǒu)很(hěn)大優勢。 

3.轉化反應問題解決指南                

下面的指南可(kě)用(yòng)于解決轉化過程中(zhōng)所出現的問題。

無菌落或液體(tǐ)培養基中(zhōng)無細菌生長(cháng)
• 即使 T7 表達為(wèi)嚴格調控型，但是 T7 表達宿主菌中(zhōng)也可(kě)能(néng)存在低水平的基礎表達。如果表達的蛋白可(kě)能(néng)有(yǒu)毒
  性，表達質(zhì)粒的轉化應使用(yòng)下列系統：
• I^q 菌株中(zhōng)過量表達的 LacI^q 抑制物(wù)能(néng)夠降低 T7 RNA 聚合酶的基礎表達。
• 在 lysY 菌株中(zhōng)，突變的 T7 溶解酶與 T7RNA 聚合酶相結合，從而減少目的蛋白的基礎表達。誘導後，新(xīn)合
  成的 T7 RNA 聚合酶抵消了溶解酶作(zuò)用(yòng)，目的蛋白得到表達。
• 30℃ 或室溫培養也可(kě)減輕毒性問題。
• 檢查抗生素濃度（用(yòng)對照質(zhì)粒檢測）。、

電(diàn)泳無蛋白或無蛋白活性
• 檢查毒性—細胞可(kě)能(néng)删除或缺失了表達質(zhì)粒的元件。如果有(yǒu)毒性表達問題，試用(yòng)I^q和/或 lysY 宿主以減少基礎
  表達。
• 培養用(yòng)于誘導蛋白表達的細胞。誘導前，将樣品平行塗布于有(yǒu)抗生素和無抗生素選擇标記的平闆。如果有(yǒu)毒性
  産(chǎn)生，則兩個平闆菌落數會有(yǒu)顯著的不同。在含抗生素的平闆上，菌落生長(cháng)數量極少（表明質(zhì)粒丢失了）。

誘導蛋白不可(kě)溶

T7 表達蛋白經常産(chǎn)量非常高，導緻目的蛋白不可(kě)溶，解決方案如下：
• 低溫誘導（低溫 12-15℃ 過夜）
• 降低 IPTG 濃度至 0.01 mM-0.1 mM
• 縮短誘導時間（可(kě)以縮短至 15 分(fēn)鍾）
• 細胞生長(cháng)早期開始誘導（OD₆₀₀ = 0.3 或 0.4）