Real-Time qPCR（RT-qPCR）優點衆多(duō)，目前已成為(wèi)生命科(kē)學(xué)領域的一項常規技(jì )術，越來越多(duō)的研究文(wén)章中(zhōng)涉及到RT-PCR實驗，也基本上被Real-Time qPCR所替代。近十幾年來，RT-qPCR的論文(wén)大量發表，仍面臨着專業規範的問題。

主要表現在以下兩個方面>>

01  70%-80%提供數據仍不采用(yòng)PCR實驗指南（MIQE）數據規範及實時定量PCR數據的結構化語言和報告指南（RDML）語言規範，表達不規範、說服力不足、結果表述不清、數據無法重複等問題導緻被撤稿。

02  追求試劑“低價”或“品牌崇拜”，缺乏科(kē)學(xué)的試劑質(zhì)量評價 方法，方法體(tǐ)系的不嚴謹将造成錯誤的結論。

2017年Stephen Bustin等調查顯示——說一套，做一套，RT-qPCR是分(fēn)子生物(wù)研究中(zhōng)缺乏重複性的典範。（Talking the talk, but not walking the walk：RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecularresearch）作(zuò)者指出許多(duō)分(fēn)子生物(wù)學(xué)研究缺乏重現性的根本原因是分(fēn)子測量方法報告不充分(fēn)。RT-qPCR是RNA定量最直接的測量技(jì )術之一，廣泛應用(yòng)于研究、診斷、法醫(yī)和生物(wù)技(jì )術應用(yòng)，盡管定量PCR實驗指南(MIQE)旨在提高RT-qPCR數據報告的規範性和透明度，但調查顯示錯誤的試驗方法、不适當的數據分(fēn)析和不充分(fēn)的報告仍然普遍存在，大多(duō)數已發表的RT-qPCR數據可(kě)能(néng)造成實驗結論誤導。

01

結果再現性問題

2013年，《自然》(Nature)雜志(zhì)發表的一篇論文(wén)綜述得出結論，自MIQE指南發布以來，有(yǒu)關RT-qPCR方案的必要信息的報告實際上有(yǒu)所惡化。雖然指南強烈建議納入必要的技(jì )術信息，但分(fēn)析的10篇論文(wén)中(zhōng)沒有(yǒu)一篇報道了這一信息。這意味着沒有(yǒu)向讀者提供任何有(yǒu)關RNA完整性、RNA純度、RT條件或PCR效率的信息，而且所有(yǒu)的出版物(wù)都使用(yòng)了一種不恰當的數據分(fēn)析方法，這種方法在15年前已經被質(zhì)疑。作(zuò)者對《自然》雜志(zhì)的20篇近期論文(wén)進行了重複分(fēn)析，得出了基本相同的結論。更諷刺的是，報道透明度與期刊的影響因子呈負相關。

02

研究RNA表達的方法

RNA圖譜分(fēn)析依賴于多(duō)種方法，有(yǒu)些方法相對簡單，有(yǒu)些方法則複雜得多(duō)，有(yǒu)些方法限制于低通量，還有(yǒu)一些方法允許并行處理(lǐ)大量樣本。作(zuò)者對目前使用(yòng)的主要RNA分(fēn)析方法進行了簡要概述，闡述了許多(duō)使用(yòng)基于RNA的方法發布的數據的可(kě)靠性和生物(wù)/臨床相關性引發激烈辯論的問題，并闡明了導緻這些結果不可(kě)靠且需要修正的各種原因

01PCR是目前大多(duō)數使用(yòng)的方法，而使用(yòng)凝膠電(diàn)泳進行PCR分(fēn)析仍在繼續使用(yòng)。對PCR相關衍生的問題的認識由來已久，早在1992年就有(yǒu)第一份報告描述了實驗室内和實驗室之間對複制和連續标本進行評估的不一緻性。缺乏一個涉及PCR的動态過程的理(lǐ)論理(lǐ)解，特别是關于不可(kě)複制或意想不到的擴增産(chǎn)物(wù)的擴增，在幾十年前也被強調。這些觀察結果和由此産(chǎn)生的影響在很(hěn)大程度上被忽略了。
02

qPCR和RT-qPCR是快速、簡單定量核酸的方法，并繼續被廣泛使用(yòng)，2016年PubMed搜索逆轉錄實時PCR或RT-qPCR或qRT-PCR，有(yǒu)近5400個引用(yòng)。但是該方法的再現行。可(kě)靠性和一緻性收到質(zhì)疑，

03

微陣列技(jì )術與RT-qPCR相比可(kě)以處理(lǐ)更多(duō)的樣本，比但由于執行和分(fēn)析數據所需的複雜性和時間的增加，這種方法的流行度正在下降，2016年PubMed搜索“微陣列”一詞大約有(yǒu)1600個引用(yòng)。

04

RNA-seq是所有(yǒu)RNA profiling方法中(zhōng)技(jì )術最複雜、最昂貴、最耗時的一種，使得複制或重複實驗的可(kě)行性較低。

05

另外兩種中(zhōng)等通量的RNA分(fēn)析方法是NanoString公(gōng)司的nCounter分(fēn)析系統和Thermo Fisher公(gōng)司的OpenArray系統。前者的優點是不需要RT步驟，後者減少了所需的樣品處理(lǐ)量。比較兩種技(jì )術和RT- qPCR的mRNA豐度分(fēn)析發現，三種方法的結果具(jù)有(yǒu)廣泛的可(kě)比性。然而，盡管NanoString和OpenArray的結果有(yǒu)很(hěn)好的相關性，但RT- qPCR數據與兩者有(yǒu)顯著差異。作(zuò)者将其歸因于常規RT-qPCR需要大量的移液操作(zuò)，從而增加了樣品制備的可(kě)變性。這些結果也表明，即使以适當的方式進行了技(jì )術和分(fēn)析，結果也可(kě)能(néng)是不一緻的。這也存在一種可(kě)能(néng)，即RT-qPCR結果是正确的，而其他(tā)兩種方法得到的結果是錯誤的。

03

RT-qPCR存在的問題

RT- qPCR工(gōng)作(zuò)流程表面上簡單的結果是，一方面，許多(duō)未經培訓和不熟練的操作(zuò)人員采用(yòng)了這項技(jì )術。另一方面，不知道從哪裏查找并識别問題所在，确定報告的結果是否可(kě)能(néng)是真實的。下面概述了妨礙對結果進行一緻解釋的方法問題，并舉例說明了為(wèi)什麽報告的結果常常如此不可(kě)靠。

01RNA的質(zhì)量

相關的質(zhì)量控制措施是任何分(fēn)子生物(wù)學(xué)實驗前的必要準備工(gōng)作(zuò)，包括确保可(kě)靠的qPCR檢測。RNA在提取和保存過程中(zhōng)有(yǒu)各種物(wù)理(lǐ)和化學(xué)因素的降解核酸，因此純度和完整性是非常重要的。RIN值大于5的總RNA可(kě)以劃分(fēn)為(wèi)優質(zhì)RNA，大于8的RNA可(kě)以劃分(fēn)為(wèi)完美RNA。這并不是一個理(lǐ)想的分(fēn)類，因為(wèi)降解與抑制類似，它不是一個恒定或穩定的過程，而是以不同的方式影響轉錄。這種不一緻的一個嚴重後果是，對純度或降解程度不同的樣品進行比較，可(kě)能(néng)會顯示出差異，實際上并沒有(yǒu)差異，或者掩蓋了任何實際差異。這種不一緻性直接影響基因表達結果，從而會影響實驗結論。

02逆轉錄步驟

在首次PCR實驗報道後不久，結合RT和PCR步驟檢測RNA靶點的潛力就被發現了，并在随後不久被建議将其用(yòng)作(zuò)定量分(fēn)析。随後發現，定量RNA并不像定量DNA那樣簡單，比如RNA逆轉錄後通過PCR進行擴增取決于RNA濃度和引物(wù)設計以及在引物(wù)結合位點避免大量的二級結構，不同的RT酶受到這些二級結構的不同影響。逆轉錄步驟實際上是可(kě)變的，因為(wèi)它是由不同的實驗人員進行的，實驗人員使用(yòng)了不同數量的RNA、各種cDNA反轉錄的方法和不同的逆轉錄酶。這導緻了不同實驗室報告的RT-qPCR結果可(kě)能(néng)不一緻，而且很(hěn)難确定哪些結果是真實的，哪些結果是錯誤的，尤其是在沒有(yǒu)足夠的分(fēn)析設計參數和實驗方案信息的情況下。

03PCR步驟

聚合酶鏈反應的穩定性并不像看上去那麽好，這有(yǒu)幾個原因：

a.許多(duō)已發表的PCR分(fēn)析要麽設計不充分(fēn)，不可(kě)能(néng)隻擴增預期的目标，要麽發表的信息不正确，導緻發表錯誤的引物(wù)或探針序列；

b.最佳的PCR性能(néng)在很(hěn)大程度上取決于适當的模闆制備方法；

c.認為(wèi)qPCR檢測分(fēn)辨率足夠高的假設是錯誤的。

d.不同制造商(shāng)的“定量PCR預混液”是不同的，不同預混液可(kě)能(néng)會影響最後的“差異倍數”值；

e.對于一些目的基因，選擇一步法RT-qPCR和兩步法RT-qPCR也會造成結果的不一緻；

f.許多(duō)商(shāng)業化熱啓動Taq在熱啓動前似乎沒有(yǒu)經制造商(shāng)的封閉性測試，容易産(chǎn)生非特異性擴增，形成引物(wù)二聚體(tǐ)；

g.目的基因和内參基因的擴增效率不在線(xiàn)性範圍内，而且二者的擴增效率也不一緻，這極大影響了實驗結果的真實性。

04

規範操作(zuò)建議

01引物(wù)和探針的驗證

由于任何PCR檢測的特異性和效率都嚴重依賴于引物(wù)和探針，如果使用(yòng)，這些都需要仔細檢查。實際應用(yòng)中(zhōng)有(yǒu)頻繁的錯誤，包括簡單的排版錯誤，對寡核苷酸序列取向混亂，缺乏特異性的引物(wù)，設計跨内含子的PCR擴增子。

02測定核酸的質(zhì)量和完整性

核酸的質(zhì)量和完整性對于定量結果的影響是很(hěn)大的，報告中(zhōng)為(wèi)提供此項内容，意味着永遠(yuǎn)不清楚作(zuò)者是否真的檢查了抑制劑的存在，并确定了RNA樣本的完整性，或者隻是不報告他(tā)們的結果。

03RT步驟做3個重複

RT步驟應該以3個重複的方式進行，而對于每個RT反應隻進行一個qPCR就足夠了。

04PCR的擴增效率應該一緻

擴增效率的不一緻，在使用(yòng)2^-△△cq進行基因表達分(fēn)析時，得到的fold changes值是不準确的，不是真實變化值，這可(kě)能(néng)會極大地提高基因表達分(fēn)析的準确性。

05選擇穩定表達的内參

使用(yòng)多(duō)個、穩定且經過驗證的内參基因對RT-qPCR數據歸一化至關重要，因為(wèi)它消除了固有(yǒu)技(jì )術或實驗誘導的差異。

06提供原始數據

Cq數據應該作(zuò)為(wèi)補充信息提交，可(kě)以以電(diàn)子表格的形式提交，也可(kě)以直接以RDML格式導出。

為(wèi)了幫助科(kē)研用(yòng)戶更好地甄别定量試劑的特異性和穩定性，提高實驗的重現性可(kě)嚴謹性，我們推出了NTC挑戰市場活動（僅擴增無模闆陰性對照），得到了熱烈反響，在活動推出一個月以來，我們收到了來自不同單位的大量的對比數據，充分(fēn)證明了試劑間存在的差異會導緻定量結果的巨大差異，下面附上三個案例：

案例一

北大某課題組，所用(yòng)試劑為(wèi)QST-100和國(guó)内B公(gōng)司、Y公(gōng)司，使用(yòng)儀器為(wèi) ABI 7500.

由擴增曲線(xiàn)和CT值可(kě)知，QST-100的CT值最高，特異性和穩定性最好。

案例二

農科(kē)院某課題組，所用(yòng)試劑為(wèi)QST-100、國(guó)内Y公(gōng)司、V公(gōng)司和國(guó)内T公(gōng)司，所用(yòng)儀器為(wèi)伯樂C1000.

由擴增曲線(xiàn)和CT值可(kě)知，QST-100的CT值最高，特異性和穩定性最好。

案例三

中(zhōng)山(shān)大學(xué)某課題組，所用(yòng)試劑為(wèi)QET-100和國(guó)外T公(gōng)司，使用(yòng)儀器為(wèi)ABI QuantStudio DX

    

由擴增曲線(xiàn)和CT值可(kě)知，QET-100的CT值最高，特異性和穩定性最好。

從客戶反饋的報告來看，市面上大多(duō)數試劑未能(néng)滿足MIQE無模闆對照不出現擴增的條件，導緻實驗數據的可(kě)信度降低，強烈建議科(kē)研用(yòng)戶選擇符合MIQE的試劑。  QST-100在客戶端也受到了廣泛好評  

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