作(zuò)為(wèi)新(xīn)一代RNA原位雜交技(jì )術的代表，美國(guó)Bio-Techne旗下的Advanced Cell Diagnostics（ACD）品牌研發的RNA原位雜交檢測技(jì )術，包括RNAscope，Basescope，miRNAscope已涵蓋了對所有(yǒu)RNA（長(cháng)度大于300nt的長(cháng)鏈RNA、50-300nt的RNA片段、外顯子跳躍的RNA、環狀RNA、以及17-50nt的小(xiǎo)RNA，例如miRNA、siRNA、ASO等）的原位檢測。

在腫瘤、神經、代謝(xiè)等領域，非編碼小(xiǎo)RNA作(zuò)為(wèi)一類調節性RNA分(fēn)子，越來越多(duō)受到研究人員的關注，它們在一些疾病的發生發展過程中(zhōng)可(kě)能(néng)具(jù)有(yǒu)關鍵性作(zuò)用(yòng)。同時，由于小(xiǎo)RNA分(fēn)子作(zuò)為(wèi)一類基因表達調節性因子，在基因治療領域也具(jù)有(yǒu)很(hěn)大潛力。針對于miRNA、siRNA、ASO等這類分(fēn)子的原位檢測，可(kě)以使用(yòng)miRNAscope實現，但同時檢測調節性分(fēn)子以及被調節的靶标RNA分(fēn)子表達變化，也具(jù)有(yǒu)非常廣泛的需求。為(wèi)此，ACD日前推出了RNAscope Plus技(jì )術，将對小(xiǎo)RNA的檢測和mRNA的檢測結合起來，可(kě)以實現同一張切片上同時對1個miRNA/siRNA/ASO和最多(duō)3個mRNA分(fēn)子進行熒光檢測。

RNAscope Plus結合了miRNAscope和RNAscope分(fēn)别的探針設計以及信号放大系統，可(kě)對已有(yǒu)的小(xiǎo)RNA及mRNA探針兼容。對mRNA檢測部分(fēn)依舊采用(yòng)“雙Z型探針“及信号放大，增加小(xiǎo)RNA分(fēn)子檢測後，不影響mRNA的信号。對小(xiǎo)RNA的檢測，采用(yòng)鏈狀探針及信号放大，可(kě)針對siRNA、ASO序列進行個性化探針設計。成像後依舊可(kě)利用(yòng)分(fēn)析軟件對mRNA信号進行定量分(fēn)析。

得益于ACD專利的探針設計及信号放大技(jì )術，小(xiǎo)RNA分(fēn)子及mRNA分(fēn)子的信号最終都可(kě)獲得高信噪比。下圖展示在細胞片中(zhōng)對miR-205和3個mRNA的陽性對照探針及陰性對照探針的檢測。陽性對照中(zhōng)各個通道上的信号點清晰，陰性對照中(zhōng)全片非常幹淨，體(tǐ)現出方法的高特異性。

在小(xiǎo)鼠腦組織切片的檢測中(zhōng)，也可(kě)獲得理(lǐ)想的結果。SNORD85可(kě)在小(xiǎo)鼠腦某些細胞中(zhōng)特異性表達，下圖中(zhōng)除了對SNORD85進行檢測外，也對小(xiǎo)鼠的神經元（Rbfox3）、星形膠質(zhì)細胞（GFAP）、小(xiǎo)膠質(zhì)細胞（Aif1）同時進行檢測，可(kě)見不同靶标特異的定位特征。

針對同一個miR-205分(fēn)子，對比使用(yòng)RNAscope Plus的熒光信号與使用(yòng)可(kě)見光試劑盒miRNAscope的可(kě)見光紅染信号，二者對于miR-205不同表達豐度的細胞中(zhōng)小(xiǎo)RNA分(fēn)子的檢出結果有(yǒu)較高的一緻性，證明不同的顯色方式對于靶标的檢測沒有(yǒu)影響。

RNAscope技(jì )術是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)品牌研發的RNA原位雜交産(chǎn)品，在近年來的生物(wù)檢測領域發展迅速。與傳統的RNA原位雜交相比，RNAscope技(jì )術屬于新(xīn)一代RNA原位雜交技(jì )術，其特異性的雙Z探針設計避免了傳統長(cháng)鏈RNA探針的弊端，配以自身級聯放大檢測原理(lǐ)，可(kě)以高效敏感地檢測到目标RNA。該方法的具(jù)體(tǐ)優勢如下：

應用(yòng)廣泛

使用(yòng)RNAscope技(jì )術，靶點RNA為(wèi)大于等于300個堿基的特異序列，即可(kě)進行探針設計。因而RNAscope技(jì )術可(kě)以應用(yòng)于幾乎所有(yǒu)物(wù)種，所有(yǒu)組織以及所有(yǒu)基因的檢測。

特異性強

RNAscope獨特的雙Z（ZZ） 探針設計有(yǒu)效的防止了探針的非特異性結合，同時降低了背景幹擾。由于結合在非特異性位點的單個的Z 探針不會産(chǎn)生完整的信号放大分(fēn)子結合位點，并會在雜交過程中(zhōng)被洗脫掉，從而防止非特異性信号的放大，使得探針的信号具(jù)有(yǒu)高度特異性。探針設計合成需要2~4周時間即可(kě)完成。

靈敏度高

RNAscope方法檢測每個RNA 分(fēn)子時，隻需三對雙Z（ZZ）探針即可(kě)完成雜交和信号的可(kě)視化。

單分(fēn)子可(kě)視化和單細胞定量

使用(yòng)RNAscope技(jì )術雜交上三對及以上雙Z 探針即可(kě)在标準的顯微鏡下呈現可(kě)觀察到的點狀信号。ACD公(gōng)司提供的分(fēn)析軟件更可(kě)以定量每一個單細胞内RNA 的表達水平。

兼容降解的RNA

由于RNAscope三對雙Z探針即可(kě)檢測到目标RNA，而通常針對靶點RNA設計的探針為(wèi)20對雙Z 探針，因而即使目标RNA發生部分(fēn)降解，仍可(kě)以穩定有(yǒu)效地檢測到靶點RNA。

檢測結果穩定一緻性

RNAscope技(jì )術用(yòng)到的探針以及所有(yǒu)檢測試劑全部由工(gōng)業化合成，且該技(jì )術針對不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細胞，貼壁細胞等）已經有(yǒu)成熟的實驗操作(zuò)流程，故使得RNAscope技(jì )術檢測結果具(jù)有(yǒu)穩定性和一緻性。除了可(kě)以在實驗室進行手工(gōng)操作(zuò)外，該産(chǎn)品也可(kě)以在Leica以及羅氏Ventana自動平台上運行，為(wèi)結果的一緻性和穩定性提供了可(kě)靠的依據。

多(duō)通道多(duō)靶點同時檢測

由于RNAscope技(jì )術可(kě)以同時進行多(duō)通道探針雜交以及信号放大，故在可(kě)見光檢測中(zhōng)可(kě)以在同一張切片上同時檢測兩個靶點；而在熒光檢測過程中(zhōng)，可(kě)以在同一張切片上檢測三個或三個以上靶點RNA。

在RNAscope技(jì )術的基礎上，ACD品牌旗下的Basescope技(jì )術可(kě)以檢測RNA水平的外顯子跳躍，點突變，環狀RNA等；miRNAscope可(kě)以原位對小(xiǎo)RNA，包括miRNA, siRNA, ASO進行追蹤定位；而近年來推出的RNAscope HiPlex技(jì )術則可(kě)以在一張石蠟切片上同時檢測最多(duō)12個RNA靶标的分(fēn)布定位，成為(wèi)神經科(kē)學(xué)，腫瘤微環境研究以及單細胞測序後驗證等領域的常用(yòng)檢測方法。