基于模塊化設計的 DNA 高通量組裝(zhuāng)助力合成生物(wù)學(xué)研究

合成生物(wù)學(xué)是一門交叉學(xué)科(kē)，未來很(hěn)有(yǒu)可(kě)能(néng)對學(xué)術和工(gōng)業方面的應用(yòng)産(chǎn)生重大的影響，包括生産(chǎn)新(xīn)型治療藥物(wù)和疫苗、植物(wù)科(kē)學(xué)和生物(wù)燃料。其中(zhōng)許多(duō)學(xué)科(kē)都需要利用(yòng)基于生物(wù)學(xué)的化工(gōng)生産(chǎn)能(néng)力，将工(gōng)程學(xué)原理(lǐ)應用(yòng)于生物(wù)學(xué)。其重點通常是從天然生物(wù)系統中(zhōng)産(chǎn)生、表征和分(fēn)離某些天然物(wù)質(zhì)（如 DNA），并将其用(yòng)作(zuò)工(gōng)程化生物(wù)路徑的組件。合成生物(wù)學(xué)的特點是将理(lǐ)性原則應用(yòng)于這些生物(wù)組件的設計和組裝(zhuāng)，但即便是理(lǐ)性設計，引入外源 DNA 到細胞中(zhōng)的影響也很(hěn)難預測，這就需要測試多(duō)種排列組合以獲得期望的結果。加強對 DNA 片段的模塊化設計，就可(kě)以通過替換單個組件的方式來實現多(duō)樣化的潛在的組裝(zhuāng)構建。DNA 片段的模塊化設計和組裝(zhuāng)不僅可(kě)以簡化整體(tǐ)的 DNA 構建工(gōng)作(zuò)流程，還使自動化組裝(zhuāng)成為(wèi)可(kě)能(néng)，減少完成多(duō)次構建所需的時間、人力和成本，從而提高通量，并縮短總體(tǐ)開發周期。

NEBuilder^® 高保真 DNA 組裝(zhuāng)和 NEBridge^® Golden Gate 組裝(zhuāng)引領着下一代克隆技(jì )術。這兩種方法都兼容高通量工(gōng)作(zuò)流程，并已經成功通過自動化平台（例如 Labcyte^®, Inc. 的 Echo^® 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統和 SPT Labtech 的mosquito^® LV 移液工(gōng)作(zuò)站）實現了高通量無縫克隆。

無縫組裝(zhuāng)結合 Labcyte^®, Inc. 的 Echo^® 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統

使用(yòng)納升級聲波移液系統實現 PIK3CA 的模塊化 DNA 組裝(zhuāng)

在此研究中(zhōng)，NEBuilder^® HiFi 與 25 nL 移液量的 Labcyte Echo^® 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統結合使用(yòng)，來完成基于五個模塊化片段，可(kě)以編碼 PIK3CA 癌基因的組裝(zhuāng)構建。将這些模塊設計為(wèi)分(fēn)别包含發生于野生型 PIK3CA 上的四個活化突變：R38H、E542K、E545K 和 H1047R，将其克隆到 pcDNA™3.1/Zeo(+) 載體(tǐ)上，組裝(zhuāng)成 8,940 bp 大小(xiǎo)的質(zhì)粒。本實驗的目标是利用(yòng) Echo 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統，在納升級别上完成五組五個片段的模塊化 DNA 組裝(zhuāng)。該實驗通過 junction 菌落 qPCR 快速分(fēn)析驗證是否組裝(zhuāng)成功，并通過 Illumina^® MiSeq^® 測序進行核苷酸水平上的驗證。

微型化多(duō)片段 DNA 組裝(zhuāng)

在此應用(yòng)案例描述的研究中(zhōng)，NEB NEBuilder^® 高保真 DNA 組裝(zhuāng)克隆試劑盒與 Labcyte^® Echo® 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統結合使用(yòng)，基于五個模塊化片段進行 DNA 組裝(zhuāng)構建。反應體(tǐ)積可(kě)以縮小(xiǎo)到說明書推薦體(tǐ)積的 1/40，從而顯著節省試劑成本。在轉化到大腸杆菌之中(zhōng)後，首先通過 junction 菌落 qPCR 檢查組裝(zhuāng)構建是否成功，然後，采用(yòng)微型化的 Illumina^® MiSeq^® Nextera XT 方案進行測序驗證，從而進一步節省成本。

利用(yòng) Labcyte^® Echo^® 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統和 NEBuilder 高保真克隆試劑盒進行納升級DNA 組裝(zhuāng)

在該實驗中(zhōng)，将 NEBuilder^® 高保真組裝(zhuāng)試劑盒與 25 nL 移液量的 Labcyte^® Echo^® 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統相結合使用(yòng)。通過組裝(zhuāng)構建兩種獨特的質(zhì)粒，展示了基于合理(lǐ)設計的模塊化合成生物(wù)學(xué)的優勢。第一種組裝(zhuāng)包含兩個片段，設計構建可(kě)以表達 LacZ 通路的 5223 bp 大小(xiǎo)的質(zhì)粒，并在轉化到非 α 互補的菌株中(zhōng)時，能(néng)夠進行藍白斑篩選。第二種組裝(zhuāng)由五個片段構建 8,940 bp 大小(xiǎo)的質(zhì)粒，更接近典型工(gōng)業 DNA 生産(chǎn)的複雜性和大小(xiǎo)。兩片段組裝(zhuāng)成功從 20 μL 推薦體(tǐ)積縮小(xiǎo)到 100 nL，試劑用(yòng)量隻有(yǒu)原來的 1/200。對于更複雜的組裝(zhuāng)，反應體(tǐ)積成功降至原來的 1/80，而降至 1/40 時可(kě)以得到最穩健的結果。當反應體(tǐ)積減小(xiǎo)到 1/40 時，總反應體(tǐ)積為(wèi) 500 nL，每種 DNA 片段隻需要 1.25 fmoles 的加入量。這些實驗的目标是利用(yòng) Echo 525 液體(tǐ)處理(lǐ)系統，通過微量反應體(tǐ)積，完成兩個片段和五個片段的組裝(zhuāng)構建。通過 junction qPCR 快速分(fēn)析驗證組裝(zhuāng)是否成功，并通過 Sanger 測序在核苷酸水平上進行驗證。

無縫組裝(zhuāng)結合 SPT Labtech 的 mosquito^® LV 移液工(gōng)作(zuò)站

基于自動化高密度樣本存儲與微型化液體(tǐ)處理(lǐ)系統的高通量合成生物(wù)學(xué)組裝(zhuāng)構建

本應用(yòng)案例描述了一種自動化、高通量的工(gōng)作(zuò)流程，該工(gōng)作(zuò)流程已由 GeneMill 合成生物(wù)學(xué)服務(wù)中(zhōng)心（由 James Johnson 博士領導，位于利物(wù)浦大學(xué)）集成用(yòng)于構建合成 DNA。

通過将 arktic 自動化樣本管理(lǐ)系統與 mosquito X1/LV 小(xiǎo)體(tǐ)積液體(tǐ)處理(lǐ)系統相結合，可(kě)以簡化和加速 GeneMill 現有(yǒu)的手動工(gōng)作(zuò)流程。這拓展了該核心機構的 DNA 合成能(néng)力，有(yǒu)助于合成生物(wù)學(xué)研究人員獲得更多(duō)經過驗證的實驗工(gōng)具(jù)。